Формирование полноценных зубов из биоинженерных эквивалентов.
Разработка и применение биотехнологических подходов требует понимания процессов клеточной биологии, эмбрионального гисто- и органогенеза, особенностей физиологической и репаративной регенерации в различных возрастных периодах. В настоящее время большинство исследований в области клеточных технологий сфокусированы на тканевом уровне организации – полное воспроизведение органогенеза на современном этапе представляется мало возможным, но является дальнейшим логическим продолжением развития научных разработок.

В этой связи, особый интерес представляет серия экспериментальных исследований лаборатории K. Nakao, направленных на получение биоинженерных эквивалентов зубов и оценку их гистологических, гистохимических, иммунофенотипических и функциональных особенностей.

доктор Takashi Tsuji , университет Токио

Известно, что формирование зубных зачатков осуществляется на основе взаимодействия орального эпителия и клеток эктомезенхимы нейрального гребня [2]. Руководствуясь этими данными, K. Nakao с соавт. (2007) использовали в качестве исходного материала эпителиальные и мезенхимные клетки, полученные из зачатков резцов эмбрионов мышей возрастом 14,5 дней. Инъекции клеточных популяций проводили в капли коллагенового геля с получением культур в различных концентрациях (0,5?108 и 5?108 клеток/мл). Мезенхимные клетки помещались в базальную часть, эпителиальные – в апикальную. На этапе разработки метода [2] после двух суток культивирования половину образцов трансплантировали под капсулу почки мыши на две недели. Аналогичное время оставшуюся часть клеточных культур инкубировали in vitro. Формирование зубных зачатков с нормальной дифференцировкой клеток и гистогенезом наблюдалось во всех случаях in vivo при использовании материала с высокой плотностью клеток (концентрация 5?108 клеток/мл). С использованием GFP-меченых клеточных популяций было показано развитие одонтобластов, компонентов пульпы зуба, костной ткани и периодонтальной связки из мезенхимальных клеток, а амелобластов – из эпителиальных, что соответствует фундаментальным представлениям. Важно, что при использовании клеточных популяций, полученных из зубных зачатков резцов на более поздних стадиях эмбрионального развития, биоинженерные эквиваленты зубов формировались с гораздо меньшей частотой.

При культивировании клеток в коллагеновом геле in vitro также наблюдалось формирование множественных зубных зачатков к периферии от пограничной линии между эпителиальными и мезенхимными клетками уже через 2-3 дня инкубирования. В последующем происходила дифференцировка клеток в одонтобласты и амелобласты, продукция ими межклеточного вещества.

Клеточные компоненты всех биоинженерных эквивалентов зубов, полученных как in vivo, так и in vitro характеризовались экспрессией белков (эктодин, рецептор эктодисплазина), регулирующих процесс гистогенеза зубов в физиологических условиях [3].

Положительные результаты на первых этапах исследования позволили авторам перейти к оценке возможности получения нормальных зубов из их биоинженерных эквивалентов непосредственно в области их естественной локализации. Для этого, привитые в течение 14 суток под капсулой почки зубные зачатки и культуры, инкубированные in vitro двое суток, трансплантировались 8-недельным мышам в область удаленного резца нижней челюсти. Спустя 14 суток в обеих группах формировались зубы с правильной гистоархитектоникой, наличием периодонтальной связки и пульпой с сосудами и нервами.

Схема эксперимента

Заключительный этап экспериментального исследования, опубликованный в журнале Nat Methods в 2009 [4] был направлен на оценку функциональных особенностей коренных зубов, получаемых после трансплантации, соответствие их по физиологическим и биомеханическим характеристикам нормальным зубам.

Полученные in vitro зубные зачатки трансплантировались в область удаленного за три недели до операции верхнего первого большого коренного зуба. В более чем 55% случаев зуб прорезался (в среднем через 36 суток) и через две недели достигал жевательной поверхности противоположного зуба нижней челюсти, после чего рост прекращался, что доказывает чувствительность восстановленного зуба к регуляции механической нагрузкой. Неудачные результаты (45%), по мнению авторов, связаны с погрешностями в осуществлении микрохирургических манипуляций. Полученные зубы имели нормальное строение, корни были окружены цементом и периодонтальной связкой. Кроме того, характеризовались наличием бугорков на жевательной поверхности, но меньшими размерами коронки в переднезаднем и щечноязычном направлениях.

Оценку твердости, определяющей жевательную функцию зубов, оценивали с помощью теста твердости Кнупа. Нормальный показатель, характерный для коренных зубов мышей возрастом 9 недель, равен в среднем 88 единицам, чему соответствовала твердость биоинженерных зубов. Более того, исследователи оценивали взаимодействие корней с окружающей их костной тканью, т.е. функционирование периодонтальной связки. Известно, что в физиологических условиях в точке компрессии костной ткани запускаются процессы резорбции, опосредованные действием остеокластов, а в области растяжения – остеогенез [3]. В этой связи, при выполнении постоянной механической нагрузки на биоинженерные зубы в щечном направлении (в течение 17 суток) было показано, что в области компрессии кости локализуются остеокласты (положительная реакция на тартрат-резистентную кислую фосфатазу), а на противоположной, язычной стороне – остеобласты (остеокальцин-позитивные), что подтверждает вовлеченность периодонтальной связки в передаче механической нагрузке костной ткани.

В заключении, авторы оценивали проводимость ноцицептивной импульсации по нервным окончаниям пульпы зуба. Для этого устанавливали уровень экспрессии нейротрансмиттеров, участвующих в восприятии и проведении болевых раздражений (галанин (galanin) [4], пептид, связанный с геном кальцитонина (сalcitonin gene-related peptide, CGRP [5]). Был показан высокий уровень продукции CGRP, а также закономерное увеличение экспрессии галанина при болевой стимуляции.

Таким образом, в серии исследований был отработан метод воспроизведения эмбрионального органогенеза in vitro, обоснована эффективность применения клеточных продуктов, сформированных на его основе, в эксперименте in vivo, а также показаны впечатляющие функциональные результаты трансплантации полученных биоинженерных эквивалентов. Нужно отметить, что данное исследование, базирующееся на использовании эмбрионального клеточного материала, имеет, главным образом, теоретическое и экспериментальное значение, позволяя продвинуться в изучении процессов эмбрионального гисто- и органогенеза, но пока не применимо в клинической практике.

По материалам: Ikeda E., Morita R., Nakao K. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS, 2009; 106(32): 13475-80.

Литература:

1. Ohazama A., Modino S.A. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J. Dent. Res. 2004; 83(7): 518-22.

2. Pispa J., Thesleff I. Mechanisms of ectodermal organogenesis. Dev. Biol. 2003; 262: 195-205.

3. Wise G.E., King G.J. Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement. J. Dent. Res. 2008; 87: 414-34.

4. Deguchi T., Takeshita N., Balam T.A. et al. Galanin-immunoreactive nerve ?bers in the periodontal ligament during experimental tooth movement. J. Dent. Res. 2003; 82: 677-81.

5. Byers M.R., Narhi M.V. Dental injurymodels: Experimental tools for understanding neuroin?ammatory interactions and polymodal nociceptor functions. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10: 4-39.

6. Nakao K., Morita R., Saji Y. The development of a bioengineered organ germ method. Nat. Methods, 2007; 4(3): 227-30.

7. Ikeda E., Morita R., Nakao K. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS, 2009; 106(32): 13475-80. [Full Text].

Автор: Бозо И.Я.

Первая публикация в журнале Клеточная трансплантология на сайте http://celltranspl.ru

Источник: www.dental-revue.ru